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Jul 10, 2023

Révolutionner la fabrication biopharmaceutique avec la PCR Droplet Digital™ entièrement automatisée

Du développement au contrôle qualité et à l'évaluation thérapeutique continue, une absolue

Du développement au contrôle de la qualité et à l’évaluation thérapeutique continue, la quantification absolue des acides nucléiques peut être la clé pour faire passer votre produit biopharmaceutique au niveau supérieur

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Les thérapies cellulaires et géniques émergent rapidement comme des approches prometteuses pour traiter un large éventail de maladies, y compris le cancer, les troubles génétiques et les maladies auto-immunes. Ces thérapies impliquent souvent le transfert de matériel génétique dans les cellules ou les tissus d’un patient, et elles nécessitent une mesure précise et précise des acides nucléiques pour déterminer des choses comme l’expression des gènes, le nombre de cellules et les titres viraux.

Pour assurer l’innocuité et l’efficacité de ces thérapies, les fabricants de produits biopharmaceutiques ont besoin d’outils fiables pour surveiller et analyser leurs produits. La PCR numérique (dPCR) est devenue une technologie puissante pour la quantification précise et précise des acides nucléiques dans des mélanges complexes, ce qui en fait un outil essentiel pour la fabrication de thérapies cellulaires et géniques. Cependant, étant donné que les développeurs et les fabricants de produits thérapeutiques doivent obtenir la plus grande certitude pour avoir confiance dans leurs produits et leurs soumissions réglementaires, ils doivent faire preuve de discernement lorsqu’ils choisissent un système de PCR et l’appliquent à leur flux de travail.

Dans l’ensemble, la technologie de PCR numérique surpasse généralement les autres approches de quantification des acides nucléiques telles que la PCR quantitative (qPCR). Cependant, pour atteindre la plus grande précision et exactitude, les experts doivent différencier les différentes méthodes et plates-formes de dPCR, chacune avec ses forces et ses limites.

La PCR numérique™ par gouttelettes (ddPCR) est devenue de plus en plus populaire en raison de sa capacité à surmonter certaines des limites des autres méthodes de dPCR™. Contrairement à d’autres méthodes de dPCR, qui utilisent généralement des puces, des plaques ou des microréseaux pour partitionner l’échantillon en chambres de réaction individuelles, les tests ddPCR utilisent une technique d’émulsion eau-huile pour diviser l’échantillon en milliers de gouttelettes. Cette méthodologie réduit le risque de contamination croisée et produit des résultats plus précis et plus précis, avec un rapport signal sur bruit plus élevé et moins de biais d’amplification.

Un autre avantage de la technologie ddPCR est qu’elle est plus tolérante aux inhibiteurs, ce qui peut interférer avec la réaction de PCR et conduire à des résultats faussement négatifs. Les tests ddPCR sont également moins sensibles aux variations des conditions de réaction, telles que la quantité d’ADN ou d’ARN en entrée, ce qui peut affecter l’exactitude et la précision d’autres méthodes de dPCR. Lorsque ces problèmes produisent des données de mauvaise qualité, les scientifiques biopharmaceutiques doivent soit répéter l’expérience, ce qui fait perdre du temps et des réactifs, soit rechercher un utilisateur avancé pour définir manuellement les seuils et interpréter les résultats, ce qui augmente le risque d’erreur humaine. Minimiser ces problèmes avec la technologie ddPCR aide les experts à avoir confiance dans leurs résultats, ce qui est particulièrement critique pour les produits biopharmaceutiques avancés.

Des données PCR numériques précises et exactes sont cruciales dans le développement et la fabrication de thérapies cellulaires et géniques en raison des enjeux élevés impliqués. Ces thérapies peuvent potentiellement fournir des traitements qui changent la vie des patients, mais toute erreur de fabrication ou de dosage pourrait avoir de graves conséquences. Des données inexactes ou imprécises peuvent entraîner un dosage sous-optimal ou potentiellement nuire aux patients. De plus, la nature complexe de ces thérapies, impliquant plusieurs types de cellules et des modifications génétiques, nécessite une quantification précise des acides nucléiques cibles. La technologie ddPCR fournit un outil puissant pour détecter et quantifier ces cibles à chaque étape du parcours de production biopharmaceutique.

Détermination du titre viral

Les virus adéno-associés (AAV) sont l’un des vecteurs viraux les plus couramment utilisés en thérapie génique. Il est essentiel de quantifier avec précision le titre viral pour optimiser le dosage des thérapies à base d’AAV. Malheureusement, les tests traditionnels pour la détermination du titre AAV peuvent prendre beaucoup de temps, exiger beaucoup de main-d’œuvre ou être insuffisamment sensibles, les résultats étant affectés par plusieurs variables. Inversement, la technologie ddPCR peut offrir une quantification plus précise et plus précise des génomes AAV par mL, ce qui en fait un outil puissant pour la détermination du titre AAV.

Quantification de la puissance

Le nombre de copies de transgènes fonctionnels ou de particules virales présentes dans un échantillon détermine la puissance des produits de thérapie cellulaire et génique. La puissance de ces produits est essentielle, car elle a un impact sur l’efficacité de la thérapie et son innocuité globale. Bien que les méthodes traditionnelles basées sur la qPCR aient été utilisées pour la quantification de la puissance, elles ne sont pas toujours précises et fiables. En revanche, la technologie ddPCR peut fournir une quantification absolue du nombre de séquences cibles présentes, ce qui permet des déterminations de puissance plus précises et plus fiables.

Détection des contaminants

Les contaminants ne sont que trop courants et peuvent entrer dans un lot thérapeutique à n’importe quel moment du flux de travail; Cependant, peu importe où ils entrent, ils peuvent sérieusement compromettre la sécurité et l’efficacité du produit final. En particulier, les bactéries mycoplasmes sont un contaminant commun dans la culture cellulaire qui peut échapper à la détection par les méthodes microscopiques traditionnelles en raison de leur petite taille. De plus, les techniques de détection standard basées sur la culture sont laborieuses, manquent de sensibilité et peuvent prendre jusqu’à quatre semaines pour produire des résultats. En revanche, la technologie ddPCR offre un moyen fiable de détection le jour même grâce à l’utilisation de sondes spécifiques qui peuvent cibler les signatures génétiques uniques de 112 espèces de mycoplasmes.

Un autre contaminant important à surveiller dans la fabrication de thérapies cellulaires et géniques est l’ADN de la cellule hôte, en particulier dans les systèmes qui utilisent la lignée cellulaire HEK293 couramment utilisée. Bien que les cellules HEK293 soient largement utilisées pour leur capacité à produire des niveaux élevés de protéines recombinantes ou de vecteurs viraux, elles comportent également un risque de contamination de l’ADN dans les produits en aval. C’est là que la technologie ddPCR peut offrir un avantage par rapport aux autres techniques de PCR, car elle peut analyser avec précision les niveaux d’ADN de la cellule hôte pour s’assurer que la taille et la quantité des fragments se situent dans des limites acceptables. En fournissant une mesure plus spécifique et précise de l’ADN de la cellule hôte, la ddPCR peut aider à minimiser le risque de réponses immunitaires ou d’autres événements indésirables chez les patients recevant le produit de thérapie génique final.

Quantification du numéro de copie

Les produits de thérapie cellulaire, tels que les lymphocytes T à récepteurs antigéniques chimériques (CAR), se sont révélés très prometteurs dans le traitement du cancer. Cependant, l’efficacité de ces thérapies peut être affectée par le nombre de copies de transgènes présentes dans les cellules. Sans transgènes, une cellule ne contribuera pas à un traitement efficace, mais les cellules avec trop de transgènes peuvent se comporter anormalement une fois injectées à un patient. Les méthodes traditionnelles basées sur la qPCR pour déterminer le nombre de copies ne sont souvent pas assez précises pour la fabrication de thérapies cellulaires. Cependant, les tests ddPCR peuvent confirmer que les cellules thérapeutiques contiennent un nombre de transgènes qui se situe dans la plage recommandée par les régulateurs.

Le système QX ONE™ Droplet Digital PCR (ddPCR) de Bio-Rad est un système de ddPCR entièrement automatisé conçu spécifiquement pour répondre aux besoins des clients biopharmaceutiques. Le système QX ONE a été validé pour une utilisation dans la détermination du titre AAV, la quantification de la puissance, la détection des contaminants des mycoplasmes et de l’ADN de la cellule hôte et la détermination du nombre de copies de thérapie cellulaire, entre autres applications.

Le système est convivial et entièrement automatisé pour un fonctionnement à distance, ce qui réduit le risque d’erreur humaine et de variabilité. En outre, le logiciel intuitif et le flux de travail simple le rendent accessible à un large éventail d’utilisateurs, des biologistes moléculaires expérimentés à ceux qui ont peu ou pas d’expérience en PCR.

Le système QX ONE ddPCR permet un multiplexage avancé qui peut analyser jusqu’à 480 échantillons en une seule journée, permettant une analyse efficace et rentable. Il propose également un logiciel d’édition réglementaire, qui comprend des outils pour aider à la conformité aux exigences réglementaires en matière d’intégrité et de traçabilité des données, ce qui le rend adapté à une utilisation dans un environnement BPF. Ensemble, les caractéristiques du système QX ONE ddPCR en font un instrument idéal pour la fabrication de thérapies cellulaires et géniques.

Découvrez le système QX ONE ddPCR et ses nombreuses applications à bio-rad.com/QXONE

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