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Nov 04, 2023

Une méthode pour le marquage parallèle des protéines à l'échelle microscopique et un contrôle précis du degré moyen de marquage (aDoL)

Rapports scientifiques volume 13,

Scientific Reports volume 13, Numéro d’article: 8961 (2023) Citer cet article

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Une approche largement utilisée pour la conjugaison des protéines consiste à utiliser les résidus de lysine réagissant avec NHS- ou d’autres esters actifs. Cependant, il est difficile de contrôler avec précision le degré de marquage (DoL) en raison de l’instabilité de l’ester actif et de la variabilité de l’efficacité des réactions. Ici, nous fournissons un protocole pour un meilleur contrôle de l’aDoL en utilisant les réactifs Click Chemistry sans cuivre existants. C’est une réaction en deux étapes avec une purification entre les deux. Brièvement, les protéines d’intérêt ont d’abord été activées avec l’azoture NHS. Après avoir éliminé l’azoture NHS n’ayant pas réagi, la protéine-N3 est ensuite réagie avec une quantité limitée de clic complémentaire. Nos études ont montré que l’étiquette cliquable réagit pleinement avec la protéine-N3 après 24 h d’incubation et ne nécessite donc pas d’étapes de purification supplémentaires. En tant que tel, l’aDoL est égal au rapport molaire d’entrée de la balise clic et de la protéine. En outre, cette approche offre un moyen beaucoup plus simple et plus économique d’effectuer un étiquetage parallèle à l’échelle microscopique. Une fois qu’une protéine est préactivée avec N3-NHS, tout fluorophore ou molécule avec l’étiquette de clic complémentaire peut être attaché à la protéine en mélangeant les deux ingrédients. Les quantités de protéines utilisées dans la réaction de clic peuvent être à n’importe quelle quantité souhaitée. Dans un exemple, nous avons marqué un anticorps en parallèle avec 9 fluorophores différents en utilisant un total de 0,5 mg d’anticorps. Dans un autre exemple, nous avons étiqueté Ab avec une valeur aDoL ciblée de 2 à 8. Dans une étude de comparaison de la stabilité, nous avons constaté que le fluorophore conjugué utilisant le protocole de clic suggéré restait attaché à la protéine plus longtemps qu’avec le marquage NHS-fluorophore standard.

Les protéines jouent un rôle central en biologie et les rendre visibles ou détectables est essentiel pour que les chercheurs puissent étudier leurs fonctions et leurs interactions. En 2001, Sharpless a publié un article de référence décrivant une stratégie simple consistant à coupler deux molécules ensemble en « cliquant »1. Plus tard, Meldal et Bertozzi ont développé la chimie et l’ont rendue disponible pour une large application2,3, pour laquelle 20 ans plus tard, leurs travaux ont été reconnus et récompensés par le prix Nobel de chimie. La chimie bioorthogonale ou chimie du clic, a démontré de grands avantages pour cibler, avec une spécificité élevée, des protéines individuelles modifiées avec des sondes ou des marqueurs dans des systèmes complexes4,5,6,7,8,9,10. D’autres progrès significatifs ont également été réalisés dans les méthodes de marquage chimio- et régiosélectif pour obtenir une seule étiquette attachée aux protéines natives11,12. Pour des revues complètes et des livres sur la bioconjugaison des protéines, veuillez consulter13,14,15. Il convient également de mentionner que le résidu de cystéine est une autre cible populaire pour la conjugaison des protéines spécifiques au site. La plupart des protéines ne contiennent pas de thiols libres natifs qui peuvent être ciblés, et la réduction des liaisons disulfure peut avoir des effets délétères sur la structure, donc l’introduction d’un seul résidu de cystéine via une mutation ponctuelle est une approche privilégiée pour avoir une seule étiquette attachée à un emplacement protéique précis. Indépendamment des approches mentionnées ci-dessus, l’ester classique de N-hydroxysuccinimide (NHS) et d’autres esters actifs demeurent le groupe fonctionnel préféré pour attacher le fluorophore, le chromophore, la biotine et l’ADN à une protéine via le résidu de lysine16,17. L’abondance de résidus de lysine dans la plupart des protéines facilite l’étiquetage, et c’est une réaction en une étape plus une purification en une étape. Néanmoins, en raison de l’instabilité (hydrolyse) de l’ester actif, de l’incohérence de l’efficacité des réactions et des préoccupations de surmarquage affectant la fonction de la protéine18, la tâche reste ardue.

Ici, nous décrivons une méthode d’étiquetage qui garantit une aDoL ciblée en utilisant des réactifs chimiques à clic sans cuivre facilement disponibles. Les sites de fixation sont stochastiquement ciblés sur les résidus de lysine à la surface de la protéine, et l’aDoL est le nombre moyen de marqueurs (fluorophores) conjugués à chaque protéine. Il s’agit d’une réaction en deux étapes avec une étape de purification entre les deux (illustrée à la Fig. 1). Dans un premier temps, la protéine a été activée avec N3-NHS et l’excès de N3-NHS a été éliminé après la réaction. Dans la deuxième étape, la protéine-N3 a été mélangée avec du fluorophore-DBCO à un rapport molaire équivalent à l’aDoL souhaité. Après une incubation de 24 heures, la protéine marquée est prête à l’emploi.

Schéma d’étiquetage des clics avec aDoL ciblé. Le nombre entre parenthèses représente le rapport molaire dans la réaction. L’utilisation de 15X l’excès molaire de N3-NHS donnera généralement ~ 5 N3- par protéine à condition que la protéine ait suffisamment de résidus de lysine. Le degré moyen de marquage (aDoL) peut être contrôlé avec le rapport molaire d’entrée des réactifs dans la deuxième étape de réaction. L’étiquette peut être DBCO, ou d’autres cyclooctynes complémentaires à N3-.

Le succès du protocole de marquage proposé repose sur deux conditions : (1) dans l’étape d’activation, le nombre moyen de N3 attaché à la protéine doit être supérieur à l’aDoL souhaité, (2) le fluorophore-DBCO ajouté doit être entièrement consommé dans la deuxième étape, rendant ainsi une purification supplémentaire inutile. Le protocole a été testé sur deux systèmes protéiques, une petite protéine : l’apomyoglobine (apoMb, 17 kDa) et un anticorps (150 kDa). Ils ont tous deux été marqués avec AZ488-DBCO, atteignant aDoL de 2-4 pour apoMb et aDoL de 2-8 pour les anticorps. La chromatographie et la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) ont été utilisées pour surveiller la réaction de marquage, détecter les fluorophores n’ayant pas réagi et caractériser la luminosité des conjugués.

FCS mesure la fluctuation du signal des molécules fluorescentes lorsqu’elles diffusent librement à travers un volume d’éclairage bien défini (~ 1 fL). Cette technique élégante a été introduite il y a plus de 30 ans19, mais n’a pas été fréquemment utilisée jusqu’au milieu des années 90, lorsque des ordinateurs plus rapides et des instruments avancés sont devenus disponibles. Un aperçu complet des principes de base et des applications du FCS peut être trouvé ailleurs20. La courbe d’autocorrélation calculée fournit des informations sur le taux de diffusion des molécules fluorescentes. Une molécule plus petite (par exemple, un fluorophore libre) a un taux de diffusion plus rapide qu’une protéine marquée par fluorescence et se reflète donc dans une courbe d’autocorrélation décalée à droite pendant la réaction de marquage.

L’ester NHS de l’acide azidoacétique (N3-NHS) et tout le fluorophore-DBCO ont été achetés auprès de Click Chemistry Tool (Scottsdale, AZ). Les colonnes de dessalage AlexaFluor 488-SDP (AF488-SDP) et Zeba ont été achetées auprès de Thermo-Fisher Scientific (Waltham, WA). Cy5-NHS ont été achetés auprès de GE healthcare (Buckinghamshire, Royaume-Uni). NGAL, anticorps anti-NGAL et anticorps anti-biotine utilisés dans l’étude ont été produits en interne par le laboratoire Abbott21 (Abbott Park, IL). L’apomyoglobine a été achetée de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO.). Dylight 649 a été acheté auprès de Jackson ImmunoResearch Inc (Westgrove, PA). Chromlink Biotin a été acheté auprès de Vector Laboratories (Newark, Californie).

L’anti-NGAL Ab1 à 2 mg / mL dans le tampon PBS a été mélangé avec un excès molaire huit fois d’ester AF488-SDP. La réaction a été réalisée à 2–8 °C pendant la nuit. L’excès d’AF488-SDP a été éliminé en faisant passer l’échantillon deux fois à travers des colonnes de dessalage Zeba.

1 à 2 mg de N3-NHS ont été dissous dans du DMSO jusqu’à une concentration finale de 10 mg/mL. La concentration de N3-NHS a été déterminée en pesant ou en mesurant avec précision le produit hydrolysé, NHS, ε260 nm = 9700/M/cm22. Les deux méthodes ont été utilisées pour déterminer la concentration de N3-NHS. Les différences se situaient à moins de 5 %. Dans l’étape de pré-activation, un large éventail d’excès molaire de N3-NHS (quatre à cinq fois l’excès) a été mélangé avec 2 mg / mL d’anticorps ou 1,2 mg / mL d’apomyoglobine pour obtenir diverses I.R. Après une incubation de deux heures à température ambiante, le N3-NHS n’ayant pas réagi a été éliminé en faisant passer les échantillons deux fois à travers des colonnes de dessalage Zeba. L’attachement d’un groupe azido à la protéine n’affecte pas le spectre d’absorption de la protéine, donc la concentration de Ab-N3 ou apoMb-N3 est déterminée avec le coefficient d’extinction de Ab ou apoMb (Ab: ε280 = 217,500/M/cm, apoMb: ε280 = 15,900/M/cm).

Nous avons adopté deux méthodes pour déterminer le rapport d’incorporation (I.R.) de la protéine N3- à la protéine. L’Ab-N3 a d’abord réagi avec un excès de molaire de Cy5-DBCO (chaque étiquette N3 doit avoir un Cy5-DBCO attaché), l’échantillon a été injecté sur HPLC analytique pour analyse après 24 heures d’incubation, le spectre d’absorption à 8,8 min a été utilisé pour déterminer l’I.R. L’équation suivante a été utilisée pour calculer aDoL de Cy5 à Ab ([Cy5] = A663/255 000/M/cm; [Ab] = (A280 − 0,05 × A663)/217 500/M/cm; aDoL = [Cy5]/[Ab]), ce qui serait une bonne estimation de l’I.R. de Ab-N3. Les ApoMbs marqués ont été analysés par spectromètre de masse TripleTOF® 5600 (Sciex, Framingham, MA) couplé à une HPLC Eksigent MicroLC 200 (Sciex, Framingham, MA). La distribution des états chargés multiples des échantillons de protéines a été décomplexée à l’aide de la fonction de reconstruction disponible dans le logiciel Peakview d’AB Sciex. Le taux de mortalité moyen est calculé à l’aide de la formule suivante : ∑(nombre de N3 attaché à la protéine x intensité maximale)/∑(intensité maximale).

Tous les stocks de fluorophore-DBCO ont été dissous dans du DMSO à une concentration finale de 10 mg/mL, puis dilués dans un tampon PBS à ~ 100 μM. Les 2 mg/mL Ab-N3 (I.R. 7) ont été divisés en petites aliquotes (50 μL), chacune ayant réagi avec 2× équivalent molaire de AZ405-DBCO, AZ430-DBCO, AZ488-DBCO, AZ546-DBCO, AZ568-DBCO, AZ594-DBCO ou Cy5-DBCO. Les produits ont été analysés en CLHP pour déterminer l’efficacité des réactions.

La cinétique de réaction de la protéine-N3 et de l’AZ488-DBCO a été surveillée par chromatographie analytique à l’aide de la Agilent Chemstation. 50 μL du mélange ont été injectés sur le SRT-C SEC 300 analytique (colonne HPLC, Sepax) à différents moments (5 min–24 h). Les modifications du profil d’élution reflètent la progression de la réaction. Dans l’expérience, où 2 mg/mL d’Ab-N3 ont réagi avec neuf fluorophores-DBCO différents, les mélanges réactionnels ont été injectés sur la même colonne après une incubation de 24 ± 1,5 heure. Il y avait 3 h de différence entre la première et la dernière injection d’échantillon. Le détecteur a été réglé au maximum d’absorption du fluorophore correspondant. Les profils d’élution ont été utilisés pour détecter le fluorophore-DBCO n’ayant pas réagi.

Les expériences FCS ont été réalisées à l’aide d’un spectromètre de corrélation de fluorescence (ALBA, ISS, Champaign, IL) intégré à un microscope à fluorescence Nikon Eclipse TE300 inversé (Nikon InsTech Co., Ltd., Kanagawa, Japon) et à un laser Spectra-Physics Mai Tai Ti-Sapphire23. Le système est étalonné avec de l’AlexaFluor 488 20 nM préparé analytiquement avant chaque utilisation. Tous les échantillons ont été dilués à 50–100 nM dans un tampon HEPES de 10 mM (pH 7,4, contenant 0,15 M de NaCl, 3 mM d’EDTA et 0,005 % de tensioactif P20) et chargés dans une plaque inférieure en verre à 384 puits pour la mesure du FCS.

Les anticorps utilisés dans l’étude sont les anticorps anti-NGAL et les anticorps anti-biotine. Deux protocoles indépendants ont été utilisés pour comparer l’activité de liaison de l’anticorps. Dans une approche, des titrages en série ont été effectués sur l’Ab 1 anti-NGAL avec trois IR différents (I.R. 7, 15 et 24) et Ab 1 non marqué. Les Abs ont été dilués à 100 pM dans un tampon HEPES de 10 mM. Chaque Ab a été titré avec une série de 2× solution diluée de NGAL-Cy5. Après une nuit d’incubation, l’anticorps ou le complexe anticorps-NGAL-Cy5 a été capturé par des microparticules enrobées d’anticorps secondaires (IgG Ab chèvre-anti-souris), les Abs anti-NGAL utilisés dans l’étude sont des anticorps de souris. Le signal de fluorescence de NGAL-Cy5 capturé sur les microparticules a été utilisé pour comparer les activités de liaison de trois Ab-N3 à Ab non marqués.

Dans la deuxième approche, quatre anticorps anti-NGAL différents et un anticorps anti-biotine ont été marqués avec N3-NHS avec différentes IR allant de 2 à 6. Tous les anticorps marqués et leurs anticorps intacts correspondants ont été dilués à 100 pM dans un tampon HEPES de 10 mM. 100 μL de chaque échantillon ont d’abord réagi avec 5 μL de microparticules solides enrobées de NGAL à 0,1 % pendant 30 minutes, puis 15 min d’anticorps F(ab')2-Dylight649 de 50 μL à 30 nM de chèvre. Les microparticules ont été lavées après chaque étape de réaction de liaison, puis imagées sur un microscope à épifluorescence Olympus (la configuration de l’instrument et l’analyse de l’image ont été décrites précédemment24,25). Les microparticules enrobées de biotine-NGAL ont été préparées en mélangeant 10 μL 15 μM de biotine-NGAL, à 1 mL de microparticules solides de streptavidine à 0,1%. La biotine-NGAL non liée a été éliminée de la solution de microparticules avant chaque expérience à l’aide d’un laveur de plaques. Les microparticules enrobées de streptavidine ont été préparées en couplant 0,1 mg/mL de streptavidine à des particules paramagnétiques de carboxyle de 5 μm (Polymer Lab, Palo Alto, CA) conservées à 1 % (p/p) de solides en présence de 0,15 mg/mL de carbodiimide EDAC (1-éthyl-3-(3-iméthylaminpropyl)carbodiimide, chlorhydrate. Des microparticules de streptavidine sans revêtement de biotine-NGAL ont été utilisées comme contrôle négatif pour s’assurer que les signaux mesurés étaient une liaison spécifique entre l’anticorps et son antigène correspondant.

Plusieurs conditions d’étiquetage et produits d’étiquetage ont été décrits dans cette étude, les nomenclatures suivantes ont été utilisées pour plus de clarté: protéine-15×-N3-2×-AZ488, indiquant que la protéine réagit d’abord avec 15× équivalent molaire de N3-NHS, puis 2×équivalent molaire de AZ488-DBCO. Le nombre de N3-attaché à la protéine est appelé le taux d’incorporation (I.R.). Le nombre de fluorophores finaux attachés à la protéine est appelé degré moyen de marquage (aDoL). Le produit intermédiaire est appelé protéine-N3, le produit final avec fluorophores sera appelé conjugué.

Dans le premier exemple, l’anticorps a été activé avec 16× excès molaire de N3-NHS, atteignant un I.R. de 5,6. Ensuite, un rapport molaire de 2:1 d’AZ488-DBCO et d’Ab-16×-N3 a été mélangé pour obtenir un aDoL de 2. Le mélange réactionnel (Ab-16×-N3, AZ488-DBCO) a été injecté sur la colonne HPLC analytique à différents moments pour surveiller la progression de la réaction et le produit Ab-AZ488 a été recueilli pour une analyse plus approfondie. La figure 2a montre des exemples de chromatogrammes surveillés à 493 nm au fil du temps. Le conjugué Ab-16×-N3-2×-AZ488 élue à 8,8 min, tandis que le libre AZ488-DBCO élue à 16,5 min. Au début de la réaction (5 min), il n’y avait que des traces du conjugué, et la plupart des fluorophores étaient sous forme d’AZ488-DBCO libre. À 55 min, plus de 50% des fluorophores étaient attachés à l’anticorps, et 267 min, il n’y avait que des traces d’AZ488-DBCO libre. À 24 heures, aucun AZ488-DBCO libre n’a été élué de la colonne, indiquant que tous les AZ488-DBCO étaient liés à Ab-N3, ce qui permet de supposer que nous avons atteint l’aDoL visé de 2. La figure 2b montre la trace cinétique de la réaction extraite de la valeur du pic d’élution à 8,8 min. La trace cinétique a ensuite été ajustée à l’aide de l’équation de vitesse (2) dérivée de l’équation de vitesse intégrée pour la réaction du second ordre (Eq. 1).

où [A]0 et [B]0 sont les concentrations initiales de N3-DBCO et d’AZ488-DBCO, respectivement; t est le temps de réaction en secondes, x est la concentration d’AZ488-DBCO attachée à la protéine, et K est la constante de vitesse de réaction. Le K ajusté est de 4,31 ± 0,13/M/s.

a) Chromatogrammes d’Ab-16×-N3 réagissant avec 2× AZ488-DBCO en fonction du temps, surveillés à 493 nm. Le conjugué Ab-16×-N3-2×-AZ488 élue à 8,8 min, les élues libres AZ488-DBCO à 16,5 min. b) Courbes cinétiques de réaction extraites des chromatogrammes avec une valeur K ajustée de 4,31/M/s. c) Spectres d’absorption des conjugués à partir de différents temps de réaction mesurés par le PDA sur l’instrument CLHP. La légende montre le temps de réaction. (d) Courbes d’autocorrélation de AZ488-DBCO réagissant avec Ab-N3 en fonction du temps. Les courbes se déplacent vers la droite car de plus en plus d’AZ488-DBCO sont attachés de manière covalente à Ab-N3.

Nous avons théoriquement et expérimentalement confirmé que la réaction de clic était complète à 100% après une incubation de 24 heures, à condition que le DBCO-tag et le N3-tag soient à une concentration minimale de 10 μM et 25 μM, respectivement. Cependant, nous avons observé des changements de la vitesse de réaction constante ou une réaction incomplète à la deuxième étape en fonction de la taille de la charge utile et de la DoL ciblée, ce qui pourrait nécessiter une incubation plus longue ou une cible à un aDoL inférieur (voir la section supplémentaire).

La figure 2c montre les spectres d’absorption des conjugués (de différentes longueurs d’incubation) au point d’élution de 8,8 min. L’augmentation du pic de 495 nm indique que plus d’AZ488 se fixaient à l’anticorps au fil du temps. Le tableau en médaillon répertorie les aDoL calculés à partir de chaque spectre d’absorption à l’aide de l’équation décrite ci-dessous. Après 24 h d’incubation, le conjugué a atteint un aDoL de 1,8, ce qui est proche de la valeur cible de 2.

En parallèle, des mesures FCS ont également été utilisées pour suivre la progression de la réaction. Les mélanges réactionnels ont été mesurés au microscope sans aucune étape de purification. La figure 2d montre les courbes d’autocorrélation du mélange réactionnel à différents moments de réaction. Les courbes d’autocorrélation décalées à droite indiquent que plus d’AZ488-DBCO sont attachés à la protéine au fil du temps. A 24 h, la courbe d’autocorrélation du mélange réactionnel non purifié est superposée à celle du conjugué purifié CLHP, indiquant que tous les AZ488-DBCO avaient réagi avec Ab-N3. Ainsi, nous avons utilisé deux méthodes indépendantes pour confirmer l’achèvement à 100% de la réaction d’étiquetage.

0,5 mg d’Ab-17×-N3 a été divisé en 9 aliquotes et chacun a réagi avec 2× équivalents molaires de AZ405-DBCO, AZ430-DBCO, AZ488-DBCO, AZ546-DBCO, AZ568-DBCO, AZ594-DBCO et Cy5-DBCO. Tous les produits ont été chargés sur la colonne HPLC analytique après ~ 24 h d’incubation et ont été surveillés à la longueur d’onde d’absorption maximale de chaque fluorophore correspondant. Des résidus n’ayant pas réagi n’ont été trouvés que dans les échantillons AZ532-DBCO et AZ647-DBCO. Les autres ont tous pleinement réagi avec la protéine (Fig. 3). Nous n’étions pas sûrs de la cause de la réaction incomplète pour AZ532-DBCO et AZ647-DBCO, mais ces deux composés doivent être évités. Le but de cette expérience était de démontrer qu’après l’étape d’activation, la protéine-N3 peut être conjuguée avec des fluorophores, de la biotine ou d’autres petites charges utiles avec le marqueur DBCO en parallèle à des microéchelles sans besoin supplémentaire de purification, mais il faut confirmer la réactivité à 100% du réactif DBCO avec le marqueur N3- lors du test initial.

a) Profil d’élution CLHP (normalisé) des conjugués (Ab-17X-N3-fluorophore) après incubation de ~ 24 h, chacun surveillé à la longueur d’onde fluorophore correspondante. b) Spectres d’absorption des conjugués au point d’élution de 8,8 min.

Auparavant, lors du marquage des protéines avec AF488-SDP ou AF488-NHS, les fluorophores libres étaient toujours détectés dans la solution conjuguée après seulement quelques jours de stockage. Il a été suggéré que les fluorophores étaient attachés de manière non covalente à la protéine pendant la réaction de marquage, puis se dissocieraient lentement de la protéine au fil du temps, ce qui entraînerait la présence de fluorophores libres dans le conjugué protéique purifié. Nous pensons que le N3-NHS devrait être moins problématique à cet égard. L’Ab-AF488 conjugué (attaché directement par le groupe fonctionnel ester SDP) et Ab-17×-N3-2×-AZ488 ont été préparés le même jour et mesurés le jour 1 et le jour 100 à l’aide de l’instrument FCS. Après 100 jours à 2–8 °C, 15 % de l’AF488 libre a été détecté dans le conjugué Ab-SDP-AF488, tandis que le conjugué marqué par réaction SPAAC n’avait pas de fluorophores libres détectés (voir Sfig. 5). Cette expérience de comparaison directe a indiqué que notre approche de marquage par clic peut produire un conjugué plus stable, ce qui peut s’expliquer par le fluorophore-DBCO non lié de manière covalente (le cas échéant) peut toujours réagir avec la protéine-N3 au fil du temps).

L’anticorps a d’abord réagi avec 17×, 34× et 51× excès molaire de N3-NHS, et a atteint un I.R. de 7, 15 et 24 respectivement. La protéine-N3 a ensuite réagi avec AZ488-DBCO à des rapports molaires de 2, 4, 6 et 8. Après une incubation de 24 heures, les échantillons ont été dilués pour des mesures par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) sans purification. Comme prévu, AZ488-DBCO a réagi à 100% avec Ab-17×-N3 (I.R. 7) à la cible aDoL de 2 et 4, mais des traces d’AZ488-DBCO ont été détectées pour Ab-17×-N3 (I.R. 7) à la cible aDoL de 6 et 8. D’autre part, Ab-34×-N3 (I.R. 15) pourrait accueillir jusqu’à 6 AZ488 par molécule, et Ab-51×-N3 (I.R. 24) pourrait accueillir jusqu’à 8 AZ488 par molécule (voir S Fig. 4). Un protocole de réaction similaire a été effectué sur l’apoMb et a permis d’obtenir l’aDoL ciblé comme prévu (voir S Fig. 3). Cette étude suggère que l’I.R. de la protéine-N3 devrait être deux fois supérieure à l’aDoL ciblée pour assurer l’achèvement de la réaction de clic. Cependant, on sait que la luminosité de fluorescence de la protéine marquée n’est pas toujours linéairement proportionnelle au nombre de fluorophores qui s’y attachent en raison de l’auto-trempe, ou parfois appelée trempe de concentration26,27. Nous avons observé les phénomènes d’auto-extinction attendus de la protéine marquée avec les mesures FCS. La figure 4 montre qu’à un DoL de 2, la luminosité du conjugué est deux fois supérieure à celle d’un seul fluorophore AZ488-DBCO. Il y a des augmentations incrémentielles de la luminosité avec un aDoL plus élevé, mais cela ne suit pas la tendance linéaire. À un DoL de 8, la luminosité du conjugué n’est que de 3 fois supérieure à celle du fluorophore AZ488. Compte tenu de l’impact potentiellement négatif d’un marquage étendu sur la structure et la fonction de la protéine, et du gain minimal de luminosité avec une aDoL28 plus élevée, il est important de souligner que l’aDoL doit être maintenu bas. En supposant que le nombre de fluorophores par anticorps suit une distribution de Poisson18,29, même à une DoL de ~ 2, il y aura ~ 18% de la protéine avec 3 marqueurs et ~ 15% de la protéine avec 4 marqueurs et plus.

Luminosité de fluorescence des conjugués calculée à partir des mesures FCS. À aDoL de 2, la luminosité du conjugué est deux fois supérieure à celle du fluorophore simple AZ488-DBCO, il y a une augmentation incrémentielle de la luminosité avec un aDoL plus élevé, mais ne suit pas la tendance linéaire.

L’étiquette fonctionnelle, N3- n’absorbe pas à 260 nm ni à 280 nm, de sorte que la fixation de N3- à la protéine ne peut pas être confirmée par le spectre d’absorption. Les protéines avec des I.R différentes ont des spectres d’absorption très similaires (voir S Fig. 1). Nous avons adopté deux méthodes pour déterminer le rapport d’incorporation de la protéine N3- à la protéine. Dans une approche, la protéine-N3 réagit avec l’excès molaire de Cy5-DBCO, lorsque chaque marqueur N3 a un Cy5-DBCO attaché, l’aDoL de Cy5 à la protéine-N3 devrait refléter l’I.R. de Ab-N3 et l’aDoL peut être déterminé par les spectres d’absorption. Cette approche est plus appropriée pour les protéines plus grosses (par exemple, Ab), qui ont un coefficient d’extinction plus élevé et un espace suffisant pour accueillir les fluorophores. Le tableau supplémentaire 1 indiquait la valeur maximale et calculait aDoL de Ab-N3-DBCO-Cy5. Une autre approche consiste à utiliser ESI-MS et à résoudre directement le nombre de N3- par l’augmentation de masse de la protéine. Ceci est plus adapté pour les protéines de plus petite taille sans glycosylation (par exemple, ApoMb). Les spectres ESI-MS de l’apoMb-N3 sont inclus dans la section supplémentaire (S Fig. 2). Le tableau 1 répertorie l’I.R. de Ab-N3 et apoMb-N3, les deux méthodes montrent que l’efficacité de réaction se situe entre 25 et 47%. En excluant les cas sur-étiquetés, les efficacités de réaction sont à ~ 30% avec des niveaux d’I.R. inférieurs à 5.

Deux protocoles indépendants ont été utilisés pour comparer l’activité de liaison de l’anticorps lors de la modification de -N3. Dans la première approche, des courbes de titrage de liaison ont été effectuées sur Ab1 anti-NGAL à des IR de 0, 7, 15 et 24. Chaque courbe de liaison comporte 10 points de données. Toutes les courbes de liaison sont superposables, ce qui indique qu’il n’y a pas d’impact de la modification de N3 sur la fonction de l’anticorps (Fig. 5a). Dans la deuxième approche, nous avons adopté une méthode plus simple pour évaluer plus d’anticorps avec différents IR (voir la section « Matériaux et méthodes »). Toutes les concentrations de réactifs (microparticules enrobées de NGAL, Ab-Dylight 649 anti-souris de chèvre) et les conditions de réaction ont été maintenues. La figure 5b montre le signal de fluorescence des anticorps originaux et marqués N3 lors de la liaison à leur antigène correspondant. Les cinq anticorps ont une affinité intrinsèquement différente envers son antigène ciblé, ce qui se reflète dans les niveaux de signal variés pour chaque anticorps. Cependant, la variation du signal du même anticorps marqué avec une RI différente reflète l’impact de la modification du marquage. La figure 5c montre le signal normalisé de l’Abs marqué à Ab intact. Les anti-NGAL Ab1 et Ab4 ont montré que la fixation de N3 n’a pas d’impact négatif sur la fonction des protéines, tandis que les anti-NGAL Ab2, Ab3 et anti-biotine Ab ont montré jusqu’à 30% de perte d’activité de liaison à des IR plus élevés. Et il y a une tendance à l’augmentation de la perte fonctionnelle avec l’augmentation de l’IR. L’expérience de contrôle négatif (microparticules enrobées de streptavidine) a indiqué que tous les anticorps se lient spécifiquement au NGAL ou à la biotine, le signal de liaison non spécifique au niveau Ab de 100 pM est négligeable.

a) Titrage de liaison de Ab1-N3 et de son antigène, NGAL-Cy5. Ab1 et Ab1-N3 non marqués ont été maintenus à 100 pM, tandis que la concentration de NGAL-Cy5 variait de 10 pM à 5,5 nM. Les trois Ab-N3 ont une activité de liaison similaire à celle de l’Ab natif, ce qui indique un impact minimal de la fixation N3 à Ab. (b) Signal de fluorescence de l’anticorps capturé par l’antigène correspondant. (c) Activité relative des anticorps marqués N3 contre son anticorps intact correspondant.

La technique d’étiquetage présentée ici est simple et précise. Nous ne connaissons aucune méthode d’étiquetage existante qui ait les mêmes caractéristiques sans effectuer de chimiothérapie ou d’étiquetage sélectif par site. Comme mentionné dans l’introduction, l’inconvénient majeur de l’utilisation d’ester-fluorophore actif pour la conjugaison des protéines est l’incapacité de contrôler précisément aDoL en raison de l’instabilité de l’ester-fluorophore actif et de l’efficacité imprévisible de la réaction. Toutes les étiquettes ester actives ne sont pas créées égales. Les colorants fortement sulfonés, tels que les colorants Alexa Fluor®, les colorants DyLight® et IRDye® sont particulièrement hygroscopiques, aggravant encore l’hydrolyse des esters actifs. Dans un cas, nous avons détecté 37% d’Alexa Fluor® 488-NHS hydrolysé dans un flacon fraîchement ouvert par LC-MS (voir S Fig. 5). Le manuel de fabrication a également reconnu que le pourcentage de réactifs actifs est généralement > 50%, mais peut être aussi bas que 30-40%. Avec un niveau d’hydrolyse inconnu et la taille volumineuse des fluorophores, il est difficile de prédire l’efficacité de la réaction. D’après notre expérience, l’efficacité du marquage de l’AF488-NHS ou de l’AF488-SDP en protéines peut varier de 5 à 50%. Alors que le N3-NHS est petit, le N3-NHS intact et le N3-NHS hydrolysé ont des spectres d’absorption différents, qui pourraient être utilisés pour vérifier l’intégrité du réactif de marquage22. Nous avons testé divers rapports de marquage de N3-NHS à apoMb et anticorps, les efficacités de réaction étaient de ~ 30% pour les deux protéines avec l’I.R. inférieur à 5. Nous ne nous attendons pas à une efficacité de réaction de 30% pour chaque protéine et chaque lot de N3-NHS, mais cela montre une cohérence et une reproductibilité. De plus, dans un cas de sur-étiquetage, chaque fixation N3- supplémentaire n’est que de 83 Dalton, cela aurait moins d’impact sur la fonction de la protéine par rapport à un fluorophore volumineux.

L’utilité de cette méthode a été démontrée par le marquage parallèle de 9 fluorophores différents à la même protéine-N3 dans une approche en mode batch. Après l’étape d’activation, la protéine-N3 peut être conjuguée avec des fluorophores, de la biotine ou d’autres petites charges utiles avec le marquage DBCO en parallèle à des microéchelles sans besoin supplémentaire de purification. Dans un article récemment publié30, l’auteur a tenté d’évaluer l’effet de la biotinylation des anticorps sur un dosage immunologique en utilisant différentes longueurs de liant et diverses longueurs d’aDoL sur trois anticorps. Au total, 150 conditions d’étiquetage ont été réalisées, ce qui nécessite 150 purifications indépendantes. Si notre approche avait été utilisée, les trois anticorps seraient d’abord activés avec N3-NHS, après purification, chaque anticorps pourrait ensuite être divisé en 50 aliquotes et réagir avec différents rapports des 5 liants, et le produit résultant pourrait être directement utilisé sans purification supplémentaire. Le nombre total de purifications aurait été réduit de 150 à 3.

Comme indiqué dans la section « Résultat », le retour du bénéfice diminue avec une aDoL plus élevée pour le marquage des fluorophores en raison de l’auto-trempe de fluorescence et de l’impact possible sur la fonction des protéines. Nous avons testé cinq anticorps différents avec des I.Rs différents et comparé l’impact de N3 sur la fonction de la protéine. Comme prévu, certains anticorps ont maintenu leur activité de liaison tandis que d’autres ont perdu 30% de leur capacité à se lier à son antigène à des I.Rs plus élevés. Bien que certaines protéines puissent accueillir plus de 20 étiquettes N3, mais chaque protéine est différente, il est important de confirmer la propriété de la protéine après toute modification. Nous recommandons d’introduire une fixation 3–5-N3 à chaque protéine, ce qui est suffisant pour accueillir 2 DBCO-fluorophores dans l’étape finale de réaction. Il est également possible d’utiliser le PTCE pour réduire le groupe azido n’ayant pas réagi sur la protéine en amine après avoir réagi avec DBCO, cependant, il est important de confirmer que le PTCE n’a pas rompu la liaison disulfure de la protéine.

Dans l’ensemble, nous avons réalisé des études approfondies pour démontrer que notre approche fournit un moyen simple de mettre en parallèle des protéines de marquage en faible quantité avec aDoL bien contrôlé.

Les données sont disponibles auprès de l’auteur correspondant sur demande raisonnable.

Degré moyen d’étiquetage

Taux d’incorporation

Spectroscopie de corrélation de fluorescence

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Le travail a été soutenu par Abbott Laboratories. Les auteurs remercient Sergey Tetin pour sa discussion perspicace. Nous remercions notre collègue Rich Haack d’avoir caractérisé DBCO-fluorophores et AF488-NHS par LC-MS. Nous remercions notre collègue Patrick J. Macdonald pour ses commentaires qui ont grandement amélioré le manuscrit. Nous remercions Ray Zhao d’avoir préparé des images haute résolution de figures.

Recherche appliquée et technologie, Abbott Diagnostics Division, AP-20, Abbott Laboratories, 100 Abbott Park Road, Abbott Park, IL, 60064-6016, États-Unis

Qiaoqiao Ruan et Cheng Zhao

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Q.R. a conçu et réalisé la plupart des expériences décrites dans le manuscrit. Q.R. a écrit le manuscrit. C.Z. a effectué certaines des expériences et a participé à la rédaction du manuscrit. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance avec Qiaoqiao Ruan.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Ruan, Q., Zhao, C. Une méthode pour le marquage parallèle des protéines à l’échelle microscopique et le contrôle précis du degré moyen de marquage (aDoL). Sci Rep 13, 8961 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36163-8

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Reçu: 30 janvier 2023

Acceptée: 30 mai 2023

Publication : 2 juin 2023

DEUX : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36163-8

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